Seine Familie lebte ab 1765 in Weimar, wo sein Vater Leibarzt der herzoglichen Familie war. Hufeland studierte ab 1780 Medizin in Jena. Am 24.7.1783 promovierte er in Göttingen und übernahm die Praxis seines Vaters, der zunehmend erblindete. Er wurde allerdings nicht wie sein Vater Leibmedicus des Herzogs, sondern Hofarzt. Er war zu seiner Zeit der berühmteste Arzt in Weimar und besuchte die "Freitaggesellschaften" Goethes. Ab 1793 war er Professor der Medizin in Jena. 1801 folgte er einem Ruf nach Berlin, wo er Leibarzt des Königs Friedrich Wilhelm III. und dessen Familie wurde. Hufeland wurde zum Direktor der medizinisch-chirurgischen Militärärzteakademie ernannt und war Erster Arzt an der Berliner Charité. Abt 1810 war er auch Mitglied der Akademie der Wissenschaften zu Berlin. Im selben Jahr erhielt Hufeland den Lehrstuhl für spezielle Pathologie an der hauptstädtischen Universität. Eines seiner großen Verdienste war die Einführung und Verbreitung der Pockenschutzimpfung. Als Mitglied der Berliner Armendirektion gründete Hufeland 1810 in Berlin die erste Klinik, die mittellose Patienten behandelte. Er rief die Medizinisch-Chirurgische Gesellschaft ins Leben, die am 31.5.1833 durch Allerhöchste Kabinettsorder in "Hufeland'sche Gesellschaft" umbenannt wurde. Er schuf am 21.11.1830 die Hufeland-Stiftung für notleidende Ärzte und deren Familien. Hufeland wohnte (1826) Dorotheenstraße 3. Sein Grab befindet sich in Berlin-Mitte auf dem Kirchhof der Dorotheenstädtischen und der Friedrichswerderschen Gemeinde, Chausseestraße 126.