Nach Studium in Rostock und Greifswald wurde er 1829 zum dirigierenden Arzt einer chirurgischen Abteilung des Charité-Krankenhauses in Berlin berufen; 1832 zum außerordentlichen Professor der Medizin und 1840 zum Direktor der chirurgischen Universitätsklinik ernannt. Als leitender Wundarzt der Charité entwickelte Dieffenbach die plastische Chirurgie und korrigierte operativ das Schielen. Er ist auf dem Kirchhof II der Friedrichswerderschen Gemeinde in der Bergmannstraße 42-44 bestattet.