Der Sohn Joachim Friedrichs wurde 1608 Kurfürst, vorher hatte er u. a. in Straßburg und Heidelberg studiert. Durch seine Heirat 1594 mit Anna, der Tochter des Herzogs von Preußen, bekräftigte Brandenburg seine Ansprüche auf Preußen. 1613 trat er vom lutherischen zum calvinistischen Glauben über, wodurch das Haus Hohenzollern in religiösen Gegensatz zur lutherischen Bevölkerung des Kurfürstentums geriet. Die religiösen und politischen Spannungen führten 1615 zum "Berliner Calvinistentumult". In dessen Folge verzichtete der Kurfürst auf die Annahme seiner Konfession durch seine Untertanen: Das Prinzip des Augsburger Religionsfriedens von 1555, wonach die Religion des Volkes sich nach der des Herrschers richtet, wurde also nicht durchgesetzt. Im Jülich-Kleveschen Erbfolgestreit sicherte sich Johann Sigismund die niederländische und pfälzische Unterstützung, so daß Brandenburg aufgrund des Vertrages von Xanten im November 1614 Kleve, die Grafschaften Mark und Ravensberg erwerben konnte. Nachdem ihm 1611 Polen die Vormundschaft und Nachfolge in Preußen zuerkannt hatte, fiel 1618 das Herzogtum Preußen an ihn. Kurz vor seinem Tode gab er die Regierung an seinen Sohn Georg Wilhelm ab.